产品货号：
WH0099
中文名称：
cDNA第一链合成试剂盒
英文名称：
BaiScript II RT Kit
产品规格：
25次|100次
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本试剂盒适用于二级结构复杂和长链cDNA合成。提供了所有的用于cDNA第一链合成的试剂，其中的BaiScriptⅡ RTase为改良后的莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶（M-MLV），改良后的新RTase具有更高的模板亲和力和更低的RNase H活性，因此使其在cDNA第一条链的合成过程中具有通读复杂二级结构模板和反转录长片段cDNA的能力。产品中配备的5×BaiScriptⅡ RTase Buffer经过精心的优化，既保证了新型RTase的高效酶活，又拓宽了RNA模板量的加入范围，使得反转录出来的cDNA具有更好的质量以便用于后续的实验分析。
- 酶活效率高：高效的反转录酶活性，后续实验兼容性好。
- 底物范围广：适用于所有RNA，尤其是具有复杂二级结构的RNA模板。
- 反转片段长：cDNA第一链合成可以达到12kb。
- cDNA第一链的合成；
- cDNA文库的构建；
- 一步法RT-PCR；
- RACE分析。
本试剂盒对不同长度片段的反转录能力
实验材料：人类贴壁细胞总RNA。RT-PCR起始量：20μL反转录产物（50ng/μl)
实验结果：以上为1μg总RNA反转录后取2μL反转录产物进行10个长度不同的目标基因的扩增图
扩增体系：20μL
上样量：5μL
电泳条件：6V/cm，20min
各泳道图示：
1：产物长度120bp；2：产物长度1.0kb
3：产物长度2.5kb；4：产物长度3.2kb
5：产物长度4.6kb；6：产物长度6.8kb
7：产物长度7.6kb；8：产物长度8.9kb
9：产物长度10kb；9：产物长度12kb
| 组分 | 25次 | 100次 |
| BaiScript II RTase （200U/μl) | 25μL | 100μL |
| Oligo （dT)15（10μM) | 60μL | 240μL |
| Random （10μM) | 60μL | 240μL |
| 5×BaiScript II RTase Buffer | 150μL | 500μL |
| RNase-free ddH2O | 1mL | 2×1mL |
| Super Pure dNTPs （10mM,each) | 30μL | 120μL |
| RNasin （40U/μl) | 15μL | 2×30μL |
保存：-20℃，有效期一年。
- 用于cDNA合成反应的溶液试剂尽可能用DEPC进行处理，并在高压灭菌后使用。有些试剂不能高压灭菌时，首先用经过灭菌的器具、水等配制溶液后，再将溶液进行滤除菌处理。
- RNA样品要避免基因组DNA污染；
- 避免反复冻融RNA，使RNA保持在冰浴中处融化状态；
- 试剂盒中各组分成分应在-20℃保存；
- 在使用Random Primer时，要注意随机引物量和总RNA量之间的关系，一般建议50ng随机引物/5μg总RNA。当提高Random/RNA的比率将会提高短片段（~500bp）cDNA的合成；而当降低Random/RNA的比率将会提高长片段cDNA的合成；
- 如果模板RNA富含二级结构，可以先在65℃条件下处理5min；
- 如果反转录中使用PCR下游引物，为了防止引物错配导致的非特异扩增，可以在50℃条件下进行反转录；
- 在进行长片段扩增时，为了防止cDNA结果被破坏，建议以70℃下处理15min为酶灭活条件；
- 当使用酶类时，应轻轻混匀，避免起泡；分取之前要小心地离心收集到反应管底部，由于酶粘度高，吸取时应慢慢吸取。
- 如果要扩增长片段，需使用新鲜提取所得的完整性好、纯度高的RNA。
- 将模板RNA在冰上解冻；引物、5×BaiScriptⅡRTase Buffer、Super Pure dNTPs混合液和RNase-free ddH2O在室温（15～25℃）条件下解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。
- 按照下表的体系在冰浴的无核酸酶的离心管中配制混合液：
表1：gDNA去除反应体系成分 用量 RNA 1ng～2μg Total RNA
或1pg～2ng Poly（A) mRNAPrimer 2μL Oligo-dT（10μM)
或2μL Random Primer（10μM)
或10～15 pmole基因特异性引物Super Pure dNTPs （10mM) 1μL RNase-free H2O 补充至14.5μL - 65℃孵育5min，然后置于冰上2min。
- 在上述反应液的基础上继续加入下表所列的反转录组分：
成分 用量 上述反应液 14.5μL 5×BaiScript II RTase Buffer 4μL RNasin （40U/μl） 0.5μL BaiScript II RTase（200U/μl） 1μL - 如果引物为Random Primer则需将体系现在25℃下孵育10min，如果引物为Oligo-dT和基因特异性引物则不需要此步骤。
- 42℃孵育60min。
- 85℃加热5min（或70℃加热15min）终止反应，置于冰上进行后续实验或冷冻保存。
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